（一）RT-PCR实验原理

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是根据细胞分裂中 DNA 半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。

Real-time PCR（实时荧光定量PCR技术）

指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，在PCR扩增的每一个循环后分别检测其DNA产量荧光信号，借助计算机数据处理，描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线，根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因分子数。

（二）RT-PCR实验示意图

（三）RT-PCR实验的主要应用举例

1.检测细胞中基因表达水平。

2.检测细胞中RNA病毒的含量。

3.直接克隆特定基因的cDNA序列。

（四）RT-PCR实验步骤：Total RNA的提取

1.提取方法：以RNAiso Plus Total RNA提取试剂（货号：9108/9109 ）为例：

2.提取步骤

（1）试剂：

氯仿 

异丙醇 

75%乙醇（DEPC处理水配制） 

RNase-free水

（2）DEPC水配制方法

使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。

（3）注意事项：

使用无菌无酶的吸头；

使用一次性塑料手套和口罩进行所有试剂配制和实验操作，以避免RNase污染

3. 浓度检测

相关文档：

Real-time PCR 实时定量PCR技术.ppt