一、蛋白质印迹法的原理及特点
（一）原理
是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
（二）特点
1.检测样品中存在特异蛋白质；
2.用于细胞中特异蛋白质的定量分析；
3.用于蛋白质分子的相互作用研究。
二、蛋白质印迹法主要内容
（一）蛋白样品制备
（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（三）转膜
（四）封闭
（五）抗体杂交
（六）显影
（一）蛋白样品制备
1. 原理及步骤
由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Western Blot的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质。
（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1. 原理
根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
2. 操作步骤
①清洗玻璃板；
②灌胶：配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，加入约1mL异 丙醇封胶；凝固后，配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶；
③上样：拔掉梳子，加足够的电泳液后准备上样，吸取适量样品或者分子量标准Marker，缓慢加入至胶孔；
④电泳：上样后盖上盖子，接通电源，设置电泳条件，通常浓缩胶恒压80-100V，分离胶恒压100-120V，电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳仪停止电泳；
⑤切胶：根据目标蛋白分子量和Marker的指示切下所需条带。
（三）转膜
1. 原理
转膜一般采用“海绵-滤纸-胶块”夹心法,胶块靠近负极,膜靠近正极，因为蛋白上结合有SDS而带负电,在电流的作用下会从负极向正极运动,从而转移到膜上。
2. 操作步骤
①润湿：PVDF膜先在100%甲醇中浸泡，然后将转印膜、印迹滤纸和海绵垫浸泡于转膜缓冲液中10min；
②将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形；
③三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡；
④转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，膜与正极相连；
⑤开启电泳仪，设置电泳条件，常用恒流250mA持续 1-2h。
3. 图示
（四）封闭
1. 原理
将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用脱脂奶粉填满，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱，主要是起去除非特异性吸附的作用。
2. 操作步骤
将印迹后的 PVDF 膜置于 5%脱脂奶粉溶液中，然后将装有PVDF膜的盒子至于低速摇床，封闭1-2h。
（五）抗体杂交
1. 孵一抗原理
目标蛋白的抗体（一抗）与目的蛋白特异结合形成抗原抗体复合物，清洗未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
2. 孵一抗操作步骤
封闭后加入一抗，4℃冰箱孵育一抗过夜，回收一抗，并用TBST洗膜，洗3次，每次10min。
3. 孵二抗原理
用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是目的蛋白的位置。
4. 孵二抗操作步骤
洗膜后加入二抗，摇床上孵育1h；回收二抗，并用TBST洗膜，洗3次，每次10min。
（六）显影
1. 原理
2. 操作步骤
①在暗室铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上，滤纸吸干水分，将A和B两种试剂在EP管内等体积混合，然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，准备曝光；
②根据信号的强弱适当调整曝光时间。
（七）Western Blot基本流程概括
Western Blot 流程
蛋白样品制备
SDS-PAGE
转膜
封闭
抗体杂交
显色
三、参考文献
[1] Mishra M, Tiwari S, Gomes A V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques[J]. Expert review of proteomics, 2017, 14(11): 1037-1053.
[2] Bass J J, Wilkinson D J, Rankin D, et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research[J]. Scandinavian journal of medicine & science in sports, 2017, 27(1): 4-25.
相关文档：
Western Blot.ppt