一、基因转染的原理及特点
基因转染是将外源性基因导入细胞内的一项技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染方法大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪法属于物理方法;化学介导方法有经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
二、基因转染主要内容
以多种阳离子物质介导法（维真生物，VGF转染试剂盒）为例：
（一）细胞种板
（二）配制转染体系
（三）阳性克隆筛选
（一）细胞细胞种板
1. 原理
将细胞生长状态良好的细胞以适量的密度种到相应孔板中，保证转染效率。
培养皿/板 | 表面积(cm2) | 种板密度 | 培养液 | 混合液 | 质粒 | VGF |
10cm | 60 | 2-3×106cell/dish | 10 ml | 2×500μl | 10μg | 30-40 μl |
60mm | 20 | 8-10×105cell/dish | 3 ml | 2×150μl | 3μg | 9-12 μl |
6孔 | 10 | 2-3×105cell/well | 2 ml | 2×100μl | 2.5μg | 7.5-10 μl |
12孔 | 4 | 1-3×105cell/well | 1 ml | 2×50μl | 1μg | 3-4 μl |
24孔 | 2 | 0.5-2×105cell/well | 0.5 ml | 2×25μl | 0.5μg | 1.5-2 μl |
96孔 | 0.3 | 1000-100000cell/well | 0.1 ml | 2×5μl | 0.1μg | 0.3-0.4 μl |
2. 操作步骤
以RAW264.7细胞种六孔板为例：
将RAW264.7细胞种贴壁的6孔板，每孔种70万个细胞培养过夜，保证细胞密度为85%-90%。
（二）配制转染体系
1. 原理
大部分细胞系所使用的DNA(μg)与VigeneFection(μg)的比值为1:3或1:4，转染状态良好的细胞可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。注意：转染过程中勿向培养基中添加抗生素，以免造成细胞死亡。有无血清存在(0-20％)对转染试剂的效果无影响。
2. 操作步骤
以RAW264.7细胞种六孔板为例：
将RAW264.7细胞种贴壁的6孔板，每孔种70万个细胞培养过夜，保证细胞密度为85%-90%。
步骤（以1个孔为例）：一个EP管中加10µl转染试剂+90µl空白培养基，轻轻混匀，室温静置5min；另一个EP管中加10µg质粒（根据浓度算体积）+空白培养基，总体积为100µl；将两个EP管混合，室温静置30min。取出6孔板，轻轻洗一下细胞，每孔加入1.8ml不含PS的培养基（含10% FPS）后，加入200µl转染混合溶液，盖上盖子轻轻摇晃板子使试剂与培养基混合均匀，放培养箱继续培养24h；3. 种96孔板：第三天，将转染的264.7细胞消化下来，每个孔种2万个细胞（根据药及其复孔的数目来决定种多少个孔）；
3.操作图示
（二）阳性克隆筛选
1. 原理
嘌呤霉素（Puromycin）一种由链霉菌中获取的氨基糖苷类抗生素，具有与tRNA分子3’末端类似的结构，可以和核糖体的A位点结合，从而抑制蛋白质合成对革兰氏阳性菌产生抑制作用。可用作筛选含该抗生素的基因质粒，细胞株构建，也可当做抗菌类抗生素使用。
2. 操作步骤
1.转染48h后，吸弃完全培养基，加入终浓度为1-10 ug/mlPuromycin试剂的完全培养基2ml。
2.再培养48h后，观察细胞状态，不含嘌呤霉素的细胞会飘起死亡，转入含嘌呤霉素抗性质粒的细胞则贴壁生长。再次吸弃完全培养基，加入终浓度为1-10 ug/mlPuromycin试剂的完全培养基2ml，继续杀死无嘌呤霉素抗性的细胞。
3.再培养48h，若细胞仍然贴壁生长且几乎长满，说明目的质粒含有嘌呤霉素抗性基因，否则目的质粒不含嘌呤霉素抗性基因。
注意：筛选细胞时，细胞接种密度不能过大，以免影响筛选效率。当细胞密度比较大时，可加本试剂反复筛选，直至对照细胞完全死亡。建议的一般哺乳动物细胞选用的有效浓度范围为1-10 μg/ml,使用前要做浓度筛选，选择最佳浓度。
相关文档：
基因转染技术.ppt