一、免疫荧光的原理及特点
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
二、免疫荧光主要内容
（一）固定
（二）透化
（三）封闭
（四）孵育一抗
（五）孵育二抗
（六）染核
（七）封片
（一）固定
1. 原理
多聚甲醛能与蛋白质的氨基发生反应，导致细胞内分子相互连接成网状结构，从而维持在原位上，保存了细胞的原有形态。
2. 操作步骤
（1）将共聚焦皿的培养液吸弃，用PBS浸洗3次，每次5 min；
（2）在共聚焦小皿正中，轻轻滴加4%的多聚甲醛固定30 min，用PBS浸洗3次，每次5 min。
（二）透化
1. 原理
Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。它能溶解脂质，以增加细胞膜对抗体的通透性。
2. 操作步骤
用0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透15 min，用PBS浸洗3次，每次5 min。
（三）封闭
1. 原理
封闭液可以非特异性结合蛋白质位点，即减少抗体的非特异性结合。
2. 操作步骤
在共聚焦小皿中部滴加山羊血清，室温封闭30 min。
（四）孵育一抗
1. 原理
一抗能和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合。
2. 操作步骤
（1）吸弃山羊血清，不洗涤；
（2）滴加相应一抗，用锡纸包裹好共聚焦皿，4 ℃孵育过夜。
（3）第二日，共聚焦小皿在室温复温1 h， 回收一抗，PBS浸洗3次，每次5min；
（五）孵育二抗
1. 原理
荧光二抗能特异性结合一抗，使其带上荧光素标记。
2. 操作步骤
（1）滴加对应荧光二抗，用锡纸包裹，室温孵育1 h。注意加入二抗之后的所有操作都应该避光进行。
（2）回收二抗，PBS浸洗3次，每次5 min；
（六）染核
1. 原理
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
2. 操作步骤
（1）滴加DAPI避光孵育10 min，对标本进行染核。
（2）回收DAPI ，PBS浸洗3次，每次5 min；
（七）封片
1. 原理
抗荧光淬灭剂封片液可减缓二抗荧光素的荧光淬灭。
2. 操作步骤
滴加适量抗荧光淬灭剂封片液覆盖整个共聚焦小皿中部玻片封片。
（八）激光共聚焦显微镜使用
1. 原理
激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图象仪器。它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象。
2. 操作步骤
（1）开机，进入系统；
（2）选择适当放大倍数的物镜，放置共聚焦皿；
（3）在监视模式下，选择DAPI荧光模式，调整显微镜准焦螺旋，从目镜对细胞核进行定位；
（4）在Acquisition模式下，选择需要的荧光通路、图像分辨率、扫描速度等信息，在调整适当的荧光强度和增益量，获取免疫荧光图像。
（5）存储图像，关机。
3. 示例图片
相关文档：
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