一、免疫组化的概念
免疫组化(immunohistochemistry，IHC)是一门利用酶、荧光素、生物素、金属离子等作为示踪剂，通过抗原-抗体特异性结合，在组织切片或细胞薄片上原位示踪生物体内大分子物质动态变化规律的实用性染色技术，其主要示踪原理是基于免疫学和分子生物学的基本理论。
二、免疫组化的分类及应用
(一）分类
1.根据染色方式分类：
（1）贴片染色；
（2）漂浮染色
2.根据标志物的性质分类：
（1）免疫酶技术（酶催化的DAB显示法）
（2）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）
（二）应用
常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征，在保持原组织成分、细胞特征以及结构的情况下，IHC通过结合特异性抗体检测和分析该组织细胞中的蛋白质表达。
三、免疫组化的操作步骤（以石蜡切片为例）
（一）取材
（二）固定及脱水
（三）包埋
（四）载玻片制备
（五）脱蜡
（六）抗原修复
（七）阻断内源性过氧化物酶
（八）清洗
（九）封闭
（十）一抗孵育
（十一）清洗
（十二）反应增强液处理
（十三）清洗
（十四）增强酶标记的二抗孵育
（十五）清洗
（十六）DAB显色反应
（十七）苏木素染核
（十八）脱水
（十九）封片及阅片
四、操作步骤
一、取材
1. 刀需要锐利、洁净。
2.快速切取所需部位，1min内放入固定液，最迟不能超过5min之内放入固定液；
3.一刀切取，应在蜡版或滤纸上进行避免拉锯、牵挤压等动作；
4.定位准确。
二、固定及脱水
（一）固定：
1.试剂及方法：4%多聚甲醛固定24h。
2.作用：
（1）保持细胞的固有形态和结构；
（2）使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶的反应；
（3）防止细胞自溶，以免使抗原扩散至组织间质；
（4）保持组织、细胞的抗原性，使抗原不会灭活和发生弥漫现象。
（二）脱水：
1.预脱水：75%乙醇浸泡24h；
2.脱水：放入脱水机脱水24h。
三、包埋
（一）作用：组织形态保存完好，且能作连续切片，长期存档。
（二）操作步骤：
1.包埋机预热，使固体石蜡融化；
2.将样品置于模具上面，浸润液体石蜡，将其冷却；
3.包埋好的样品放于-20℃过夜，第二天可用于切片。
（三）注意事项：
1.防止各种异物组织包入蜡块内。
2.包埋应先放石蜡后放组织，速度尽可能快，以免凝固。
3.囊壁、管腔竖直包埋，所需切面向下包埋；扭曲组织正后包埋；多个小组织可以包在一个面。
四、载玻片制备
（一）切片厚度：4-6μm
（二）载玻片要求：表面带正电荷
（三）操作步骤：水槽加热，水温设定40℃，固定蜡块，装好刀片，匀速切片，镊子展开，铺于水面，铅笔分离，玻片捞起力求平整铺于表面，标记信息，室温冷却12h后放于4℃保存。
五、脱蜡
（一）烤片：60℃烤片2-3h，有助组织切片粘附于载玻片及脱蜡。
（二）脱蜡：脱蜡程序如下，二甲苯10min*2次，100%乙醇5min*2次，95%乙醇5min,80%乙醇5min,70%乙醇5min,去离子水5min*2次。
六、抗原修复
（一）作用:组织固定过程中形成的亚甲基桥会将蛋白交联起来，掩盖掉抗原位点；抗原修复方法会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原位点，使抗体能够与抗原位点结合。
（二）方法：
1.高温高压修复法：（1）常用缓冲液：柠檬酸钠缓冲液、Tris-EDTA缓冲液以及pH 8.0的EDTA溶液；（2）操作步骤：高压锅，1L缓冲液，加热沸腾后关火放入切片（塑料架子），盖好盖子后，继续加热至发出“滋滋”声，并开始计时2min，冷却后开盖放置1-2h水温降至常温。
2.酶修复法：常使用胃蛋白酶37℃消化10min；
3.微波修复法：微波炉加热直到溶液沸腾，然后保持沸腾20min（若组织切片易脱落，可采取保持临近沸点修复10min的方法）,取出，室温放置冷却。适用于切片易脱落组织，例如骨组织切片。
七、阻断内源性过氧化物酶
（一）常用试剂：3%过氧化氢
（二）配置方法：3%H2O2=160ml甲醇+20ml dd水+20ml 30%H2O2
（三）过氧化物酶反应：供体+H2O2══氧化供体+2H2O
（四）原理：使用带有HRP的二抗进行检测时，内源性过氧化物酶活性可能会导致非特异性或高背景染色，过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用；有文献研究认为氧化剂破坏了过氧化物酶活性。
（五）步骤：免疫组化笔圈围组织点，滴加3%过氧化氢溶液，室温静置10min。
八、清洗
（一）试剂：TBST溶液，含有0.05%Tween-20。
（二）试剂配制方法：TBST=2.4228g Tris+8g NaCl+1000ml DD水+0.05%Tween-20
（三）Tween-20的作用：清洗液里的吐温对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂，可以减少抗体对抗原的非特异性作用，可洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。
（四）步骤：3次*3min/次
九、封闭
（一）原理：用血清或蛋白封闭液进行封闭可防止抗体与组织或Fc受体发生非特异性结合，以降低背景信号并减少假阳性。
（二）封闭液: BSA、山羊血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20(0.05-0.1%)溶液PBST或者TBST。
（三）免疫组化常用封闭液：山羊血清。
（四）注意事项：
1.脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。
2.检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。
3.封闭血清一般选择和二抗同一种属的血清。
十、一抗孵育
（一）原理：抗原抗体的特异性结合；
（二）步骤：滴加适当稀释的一抗，放置于湿盒，4℃过夜孵育。
十一、反应增强液处理
（一）试剂：反应增强液；
（二）作用：有助于增强DAB反应的着色效果；
（三）方法：室温孵育20min。
十二、增强酶标记的二抗孵育
（一）试剂及方法：HRP标记的二抗，室温孵育1h。
（二）原理：HRP酶分子直接标记于二抗上，因此普通的酶标二抗即可完成。但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。
（三）常用的四种二抗方法：SABC法、SP法、Polymer酶标二抗、直接酶标二抗。
十三、DAB显色反应
（一）试剂：DAB显色液
（二）试剂配制方法：50ul的20x DAB显色液+1ml DAB工作液。
（三）原理：DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。
（四）方法：显色5-15min。
十四、苏木素染核
（一）试剂：苏木素
（二）方法：苏木素染色30s，然后镜下观察到细胞核为淡蓝色即可，染色强度不够可继续染色；过染后可用1%盐酸乙醇分化1s；1%盐酸乙醇=2ml HCL+198ml 95%乙醇。
（三）注意事项：苏木素和1%盐酸乙醇需要回收。
十五、脱水
(一)程序：脱蜡程序如下，去离子水3min*2次, 70%乙醇3min,80%乙醇3min, 95%乙醇3min,100%乙醇3min，二甲苯10min*2次。
十六、封片及阅片
（一）试剂：中性树脂
（二）方法：取出切片，晾干，滴加一滴中性树脂在切片中央，盖玻片从一边缓慢盖上，
使中性树脂均匀铺开，且无气泡产生
（三）阅片：使用显微镜观察并拍照
相关文档：
免疫组化.ppt