一、细胞活力测定的原理

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。

主要利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，测定细胞相对数和相对活力。

（一）MTT法测定的原理及特点

在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

2. 操作步骤：

①在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，培养箱中培养，待其贴壁生长。

②向培养板加入不同浓度的待测药物，将培养板在培养箱孵育；      

③每孔加 5 mg/ml MTT 溶液，继续孵育 4 h，终止培养，吸弃上清液（悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液）；

④加入DMSO（150 μL /孔），振荡10 min；

⑤在酶标仪用490nm波长测其吸光度。 

（二）CCK8测定的原理和特点

基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测方法。WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。    

WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan 。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

 2. 操作步骤：

①在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养24 h；

②向培养板加入不同浓度的待测药物；（细胞增殖-毒性检测）      ③将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

④向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；

⑤将培养板置于培养箱内孵育 1-4 h；

⑥用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3.计算公式：

细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、 CCK-8 溶液和药物溶液) ；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、 CCK-8 溶液，不含药物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、 CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。

（三）细胞克隆形实验的原理及特点

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。

细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。克隆形成率＝（克隆形成数／接种细胞数）100％

缺点：操作繁琐

优点：精确、可靠

2. 操作步骤：

①取对数生长期的各组细胞，消化并吹打成单个细胞，得细胞悬液。

②梯度倍数稀释，分别接种100个细胞于含10ml 培养液的皿中。

③细胞培养箱中培养1～2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次；

④加4％多聚甲醛，固定10 min；       

⑤去固定液，加考马斯亮蓝，染色10～30 min；

⑥用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

⑦用肉眼直接计数克隆。

三、参考内容

[1] Li W , Jia G , Qu Y , et al. Long Non-Coding RNA (LncRNA) HOXA11-AS Promotes Breast Cancer Invasion and Metastasis by Regulating Epithelial-Mesenchymal Transition[J]. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 2017, 23:3393-3403.

[2] Yueyue W , Lei Y , Lingyu Z , et al. NT21MP negatively regulates paclitaxel-resistant cells by targeting miR-155-3p and miR-155-5p via the CXCR4 pathway in breast cancer[J]. International Journal of Oncology, 2018, 53(3): 1043–1054

相关文档:

细胞活力测定.ppt