一、细胞培养的原理及特点

（一）原理

将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，制成细胞悬液，再培养于固体基质之上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。

（二）特点

1、研究对象是活细胞

2、研究条件人为可控

3、研究样本能达到比较均一性

4、研究内容便于观察、检测和记录

5、研究范围比较广泛    

二、细胞培养主要内容

（一）细胞复苏

（二）培养

（三）消化

（四）传代

（五）种板

（六）细胞计数

（七）冻存

（一）细胞复苏

1. 原理

是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

2. 操作步骤

①从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；

② 37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

③离心， 1000rpm，5min；

④弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

⑤次日更换一次培养液，继续培养。

（二）培养

1、原理

细胞培养是指在体外模拟体内环境，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

2、细胞培养的环境及条件

①环境因素

无菌环境；

适宜的温度：37-38 ℃；

适宜的渗透压；

气体环境与PH：5%CO2，PH值7.2-7.4；

②营养条件

培养基；

添加成分。

（三）消化

1、原理

使细胞脱离生长表面，由细胞团离散成单个细胞的过程叫做消化。

2、操作步骤

①用PBS冲洗细胞两次；

②加入适量胰酶，能够覆盖住细胞表面即可，轻轻摇晃培养瓶身。根据细胞种类的不同，将其置于37 ℃5%CO2条件的培养箱中等待2到4分钟不等；

③显微镜镜下观察细胞，胞质回缩、细胞不再连接成片为消化适度；

④加入含有血清的培养基终止消化；

⑤将胰酶、培养基及细胞转移至离心管中，离心1000rcm、3分钟；

⑥吸去离心管内的上清。

（四）传代

1、原理

将细胞从一个培养瓶皿分离稀释，再转移到另一培养瓶皿内生长的过程叫做传代。

细胞培养一段时间后，由于细胞密度增大，营养液中营养成分大量消耗，代谢末产物蓄积，细胞虽然还能进行代谢活动，但已经不能增殖。此时应进行传代，避免因培养环境的恶化导致细胞中毒、变性甚至死亡。

2、操作步骤

①吸去培养瓶内的旧培养液，加入PBS冲洗细胞表面；

②将细胞消化下来，吸去离心管内的上清，加入1ml培养基对细胞进行重悬；

③根据传代数量的不同，将细胞分装至不同数量的新培养瓶中，每个培养瓶内装4ml培养基；

④标记新培养瓶的细胞种类、传代时间、传代代数及细胞所有人姓名。将培养瓶放入培养箱。

（五）种板

1、原理

将细胞接种到培养板上的过程叫做种板。

2、培养板分类及选择

①培养板依底部形状不同可分为平底及圆底；

②根据孔数不同有6孔板，12孔板，24孔板，96孔板等；

③大多数细胞培养均使用平底培养板，贴壁及悬浮细胞均可使用；

④具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。 

3、操作步骤

①根据实验的不同，选择相应的孔板，计算每孔中应接种的细胞数量；

②对细胞悬液进行细胞计数；

③根据计算出的每孔细胞密度，将细胞悬液稀释相应倍数；

④将稀释后的细胞悬液分装至各孔中；

⑤将培养板放入培养箱。

（六）细胞计数

1、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。

2、操作步骤

①将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上；   

②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；

③静置3分钟，镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞按照“数上不数下，数左不数右”的原则计数；

④计算公式如下：

细胞数/ml=四大格细胞总数/ 4× 104

细胞计数板的网格由9个主要方格构成。角上的四个方格每一个被进一步分成16个较小的方格。中央的主要方格被分为25个较小的方格，每一个较小方格被进一步分为16个微型方格。

如果每个大方格内少于5个细胞，就需将样品重新离心，用更小的体积重悬细胞；如果细胞有相互重叠，或者因密度太大难以区分，就需再次稀释样品到更大的体积。

如果计数的是这些大方格中的一个，就乘1；如果计数的是较小的方格，就乘16；如果计数的是25个中央方格中的一个，那就乘25。如果细胞悬浮液在计数前稀释过，再乘上稀释倍数。

（七）冻存

1、原理

培养细胞维持传代的过程中常常遇见各种困难：如细胞性质改变、支原体污染、有限增殖系细胞传代次数有限等，应对细胞进行冻存，将其储存在液氮中，需要时再进行复苏。

2、操作步骤

①选择处于对数生长期的细胞，在收集细胞24小时前换液一次；

②将细胞消化下来，离心去上清后加入冻存液，将细胞重悬；

③细胞放入程序降温盒中，-80℃环境下过夜，再转移入液氮保存。

三、参考文献

［1］王永芬，杨爽.动物细胞培养技术.武汉：华中科技大学.2012

［2］宋今丹.组织和细胞培养技术(研究生)[M].(第2版)北京:人民卫生出版社,2011:8

［3］http://www.bioengx.com/author/jove/

相关文档：

细胞培养.ppt