概述

动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。包括光学成像等技术。

光学成像

活体动物体内光学成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP,Cyt及dyes等）进行标记。

生物学发光

生物发光(Bioluminescence)是指生物体内在酶的作用下将化学物质的化学能转化为光能的现象,该过程不需要外源性光源照射。在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。

参考文献：[1]唐春超. 萤火虫萤光素底物和生物发光探针的设计、合成和生物学评价[D].山东大学,2018.

    生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗，但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。                                                                                         

参考文献：[1]NO LLEMUTEL,魏劼沉.荧光原理和荧光素的临床应用[J].昆明医学院学报,1981(S1):84-91.

操作步骤

一、 荧光素的制备（光素酶底物D-luc）

1、物料

（1）D-Luciferin，1.0克/瓶

（2）DPBS，不含Mg2 +和Ca2 +

（3）注射器过滤器，0.2微米

2、程序

（一）在DPBS中制备新鲜的D-Luciferin原液，浓度为15mg / ml。（在超净台里用50mL离心管装20mLDPBS，再用天平称量300mgD-luc，装进离心管，和DPBS混匀即可）

（二）通过0.2微米过滤器过滤灭菌。

（三）确定10μL/ g体重的注射量。每只小鼠应接受150毫克荧光素/千克体重。 （例如，对于10g小鼠，注射100μL以递送1.5mg荧光素。）

天平使用方法

1. 了解天平的构造：天平由底盘、分度盘、横梁、平衡螺母、天平盘、标尺、游码、指针及砝码组成。

 2.天平的使用

   （1）放将天平放在水平台上

   （2）使用前将游码移至称量标尺左端的“0”刻线处。

   （3）调节平衡螺母，使指针指在分度盘的中央刻线处，使天平平衡。当指针向右偏，应将横梁上的平衡螺母向左调，即螺母调的方向与指针偏转的方向相反。

   （4）称量时，把被测物体放在左盘，把砝码放在右盘，再调节游码在标尺上的位置，直到天平指针指在分度盘的中央刻线处。

   （5）右盘里砝码的总质量加上游码标尺上游码的示数值，就是被测物体的质量，即：m物=m砝+m游；游码的示数值以游码的左侧刻度线为准。

   （6）测量完毕，把被测物体取下，砝码放回盒中，游码拨回标尺零刻度线处。 

参考文献：[1]郭丽.托盘天平的正确使用[J].品牌与标准化,2009(12):54.

操作步骤

  二、打开活体成像仪

  （一）保持麻醉机的所有旋钮均处于关闭状态

  （二）将量程为2.0Air L/min 的流量计开到最大量程

  （三）开钢瓶氧气

  （四）开减压阀0.2MPa

  （五）将量程为5.0Air L/min 的主流量计打开至1L/min

  （六）将分流量计均调至0.5L/min

  （七）将老鼠放进盒子里（诱导盒）

  （八）开挥发罐（装麻药）

注意事项：谨慎遵循步骤顺序，以免造成事故。

操作步骤

三、注射荧光素

（一）在小鼠体内腹膜内注射荧光素（脐与髂前上脊连线中外三分之一处）

四、打开软件

（一）双击桌面上   图标 ，打开软件，首先会提示您是否需要新建一个User ID或者是在下拉选项中选择一个已建好的User ID，点击OK，则之后获取的图像文件名都以此User ID开头。

（二）出现控制面板“Control Panel”界面

首先需要进行初始化即“Initialize”，使仪器内各部件回到最初始的位置和状态，同时CCD开始降温，而状态栏“System Status”则会显示实时的操作状态。当“Temperature”由红色转成绿色时，表明仪器做好了成像前准备，可以开始用软件操控仪器了。

控制面板参数介绍 

1.曝光时间（Exposure time） 

（1）曝光时间决定了信号强度，曝光时间越长，信号强度越高，推荐的设定为0.5s—5min， 若曝光5min仍未看到信号，表明动物体内确实无目标信号。 

（2）对于设置多少曝光时间可得到合适曝光水平的图像，软件设置了非常方便的自动曝光即Auto exposure功能，仪器会自动检测一个合适的曝光时间以成像。自动曝光的设置只需在Exposure time选项中点击 ▼ 两下，出现 即可。

2.Bin 值（Binning）

Bin 值表述的是将多少像素作为感光单元，bin 值越大则表示应用更多的像素作为一个感光单元，因此，bin 值越大则灵敏度越高，而分辨率会有所牺牲，当信号强度较弱时 可适当增加bin 值以获取信号。 

3.光圈大小（f/stop）

光圈大小决定了光的透过量，光圈越大，穿过光圈到达CCD的光越多，面板中的数字为 F/stop中的分母数字，因此，数字越小代表光圈孔径越大，透过的光越多，当信号较弱时 可通过增大光圈（减小数字）而增强信号探测能力。

4.视野范围（Field of View）

视野范围用于调节观测的视野大小，共有 A/B/C/D 四档可选，分别代表不同大小的视野范围，实验时根据一次观察小鼠个数选择合适的视野范围进行成像。 

5.成像聚焦（Focus）

成像的聚焦包含自动聚焦和手动聚焦功能，将成像物体调至位于CCD的聚焦平面，可使物体在最后成像清晰。对于自动聚焦，只需Subject height中填入成像物体的高度，如小鼠为1.5cm，Focus下拉选项中选择“use subject height”，仪器即会自动完成聚焦，获得清晰的物体黑白图像。

操作步骤

五、活体成像

（一）小鼠经过常规麻醉后放入成像暗箱平台，控制小鼠位置，找到一个合适的视野。

（二）开始成像，点击 “Acquire”按钮即可。

（三）处理图像及结果

六、关机

（一）关闭挥发罐

（二）关氧气瓶

（三）等待所有读数为零时关闭所有气阀

（四）刷卡下机

相关文档：

小动物活体成像.ppt